这篇发表于 Blood 的文章首次临床试验证明了 PD-1/PD-L1 联合靶向疗法的临床有效性。
鉴于其重要意义，我们的技术专家又划了次重点。
曾经不小心错过该文的您，几分钟就能快速 get 要点。
 

联合疗法的有效性及 PD-L1 表达作为有效性衡量的潜在标记

1. 这是第一次在多发性骨髓瘤尝试使用派姆单抗（PD-1 单抗，Pembrolizumab）+ 泊马度胺（pomalidomide，免疫调节药物）联用治疗方案，且取得了良好的疗效。可使 RRMM 患者产生高的总体反应率（ORR 60%），且耐受性良好。 

1. 证明在使用 PD-1 通路阻遏药物进行多发性骨髓瘤治疗时， PD-L1（骨髓瘤中表达的）和 PD-1（骨髓浸润的 T 淋巴细胞中的）均可作为潜在的生物标志物。 

特色：

首次建立了在 BM（immunologic bone marrow）活检中进行 PD-L1 免疫组化的新方法 （具体方法见下文）。
 

数据：临床 II 期实验，历时 2 年多

1. 联合用药客观反应（Objective responses）良好

                                   图 1 治疗反应 （原图 fig.2A）
PR : 部分缓解，VGPR：非常好的部分缓解，sCR/CR：严格的完全缓解/完全缓解。
 
48 名 RRMM 患者，给予静脉注射派姆单抗 200 mg，每 2 周 1 次，泊马度胺口服 4 mg 每日 1 次，持续 21 天，地塞米松口服 40 mg 每周 1 次，28 天为 1 周期。这些患者既往接受的治疗中位数为 3（2-5），中位年龄为 64 岁（35-83），所有患者已接受过 IMiD 和蛋白酶体抑制剂治疗：73%（35/48）的患者对 IMiDs 和蛋白酶体抑制剂难治，70%（31）的患者曾接受过自体干细胞移植，62%（30）的患者存在高危遗传学特征。
 
治疗反应显示 40%（19/48）的患者发生了 3-4 级不良反应：包括血液学毒性 40%（19），高血糖 25%（12）和肺炎 15%（7）。自身免疫反应包括肺炎 13%（6）和甲状腺功能减退症 10%（5），多数小于 2 级，中断治疗即可恢复。
 

1. 患者客观反应良好

60%（29/48）患者产生了客观反应（见图 1），其中8%（4）得到了严格的完全缓解/完全缓解（sCR/CR），19%（9）有非常好的部分缓解（VGPR）和 33%（16）得到了部分缓解（PR）（图 1 A）；中位反应持续时间为 14.7 个月，中位随访 15.6 个月，无进展生存期（PFS）为 17.4 个月，总生存期（OS）未达。 

1. IHC 显示 PD-L1 阳性病人与治疗反应相关 

                        图 2 PD-1 和 PD-L1 免疫组化分析（原图 Fig.4）
Negative＜1% (i)，weakly 1% to 49% (ii), positive ＞50% (iii)；positive (≥5% CD3,  ≥1% PD-1)
 
上述结果令人振奋，为了探究 PD-1 和 PD-L1 的表达与 MM 治疗效果之间是否存在相关性，作者对治疗前的患者进行了PD-1（图 Bii）和 PD-L1（图 A 上）的 IHC 分析。为了更准确的统计 PD-1 和 PD-L1 的 IHC 结果，T淋巴细胞标志物 CD3（图 Bi）和骨髓瘤细胞标志物 MUM1（图 A 下）也被共染。PD-L1 评分规则：呈现任何强度的细胞膜阳性染色的肿瘤细胞的百分率。

29 例病人治疗前骨髓瘤细胞中 PD-L1 IHC 显示（图 2 A）：10 例阴性 ，6 例弱阳性，13 例阳性。对应的客观缓解率分别为 60%，50% 和 77%。PD-L1 阳性病人 vs 阴性和弱阳性病人的治疗反应（VGPR+sCR/CR）为 54% vs 20%，但 PFS 却与此无相关性。

 

1. PD-1 与 ORR 无明显相关性

对 38 例病人进行了淋巴细胞中的 PD-1 的组化检测显示（图 2 B）：6 例 CD-3⁺/PD-1⁺（激活的 T 细胞），10 例 CD-3⁺/PD-1^-（非激活的 T 细胞），22 例无明显的 T 细胞浸润 CD-3^-/PD-1^- （未检到 T 细胞），骨髓浸润的淋巴细胞中 PD-1 的表达与客观缓解率（ORR）并无明显的相关性，但有一个趋势值得注意：PD-1 阴性的患者 PFS 似乎更高。

 

表（1）PD-L1 和 PD-1 与 PFS 的相关性。
PD-L1：Negative＜1%，weakly 1% to 49%，positive ＞50%；PD-1：≥5% CD3,  ≥1% PD-1。
  

背景: 长知识

1. 关于 MM
多发性骨髓瘤（MM）发病率占所有恶性肿瘤的 1%，占血液肿瘤的 13%，其特征是骨髓恶性浆细胞浸润伴随外周血高水平的免疫球蛋白（M 蛋白）不可控的浆细胞恶性增殖。大部分无法完全治愈，被称作复发/难治性 MM（RRMM）。 

2. 为什么想到进行联合用药？

• 免疫调节剂和蛋白激酶抑制剂治疗有疗效，但是病人容易引起耐药。
• PD1/PD-L1 阻断疗法正成为癌症治疗靶标，在多个实体瘤及恶性血液肿瘤有显著疗效。肿瘤细胞高表达 PD-1 的配体 PD-L1 和 PD-L2，抑制 T 细胞杀伤肿瘤细胞的功能。因此阻断这一通路可以部分恢复 T 细胞的功能，使这些 T 细胞能够继续杀伤肿瘤细胞，如 PD-1 抗体-派姆单抗（Pembrolizumab）。 
• PD-L1 在 MM 中高表达，且在复发及治疗后的 MM 中表达更高。高表达的 PD-L1 与 MM 转变风险相关。另一方面，PD-L1 表达显示可导致 MM 细胞的抗药性。表达的PD-L1 在抗原递呈 DCs 细胞中起到促进肿瘤，提供MM中的免疫抑制微环境。
•  PD-1 在抗原激活的及「耗竭」(exhausted) T 细胞，NK 细胞，DCs 细胞中均有表达。 该表达导致了细胞毒性 T 淋巴的功能紊乱。
• 近期研究发现 MM 中的 T 细胞呈现低表达的 PD-1。表明这些细胞还未「耗竭」，单一免疫阻断效果不是很明显。

    综上所述，为了恢复 MM 中效应 T 细胞功能， 需要将其他免疫刺激策略与 PD1/PD-L1 联合起来。

3. 与何种免疫调节药物联合？ Pomalidomide

    Pomalidomide 该肿瘤调节药（IMiDs）的原因有几个方面：

• 它除了能够诱导骨髓瘤细胞凋亡外，还可通过刺激效应细胞毒 T 细胞及 NK 细胞，抑制调节型 T 细胞，改变一些列细胞因子如 IFN-γ，IL-2 等，进而增强骨髓微环境。
• 体外实验显示，Pomalidomide 可降低T细胞 PD-1 的表达，增强T细胞对异源 DCs 的增殖反应。体内实验也说明 Pomalidomide 可刺激多种细胞因子的产生如 IFN-γ，肿瘤坏死因子 TNF-α、IL-2、IL-4。它也可诱导多功能 T 细胞的激活（尤其是 CD8+ T 细胞），增加共抑制免疫检验点 BTLA T 细胞及表达 T 细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域分子 3 NK 细胞的比例， 但对 PD-1+ T 细胞不产生影响。

​4. 为什么选择克隆号为 28-8 的 PD-L1 抗体

PD-L1 IHC 28-8 pharmDx  是经 FDA 批准用于 non-squamous Non-Small Cell Lung Cancer 体外诊断的试剂。其可靠性和一致性通过了对比实验验证。
该抗体为重组兔单抗，灵敏度、亲和力和结果可重现性有保证。此外，该抗体还经过了 KO 敲除验证，特异性也得到有力保证，可排除假阳性结果。



图3. PD-L1, clone no 28-8, ab205921. 
Human Lung NSCLC tissue, All batches/lots (1,3,4,5,6) showed consistent results: A) Rabbit IgG, 5 µg/mL. No staining; B) Anti PD-L1, 2 µg/mL (ab205921 batches 1); C) Anti PD-L1, 2 µg/mL (ab205921 batches 3); D) Anti PD-L1, 2 µg/mL (ab205921 batches 4); E) Anti PD-L1, 2 µg/mL (ab205921 batches 5); F) Anti PD-L1, 2 µg/mL (ab205921 batches 6)
由以上质检数据可知，重组兔单抗 ab205921 的所有批次（1,3,4,5,6）都展示出优异的一致性结果。


图4. PD-L1, clone no 28-8, ab205921. 
Specificity testing of PD-L1 RabMAb (ab205921) by immunohistochemistry – knockout (KO) testing: loss of detection on KO cells. Strong IHC detection with anti-PD-L1 is seen in human lung adenocarcinoma tumor cell line L2987. PDL1 gene was edited in L2987 cells using TALEN constructs targeting exon4 of human PD-L1, transcript variant 1 (NM_014143.3) and complete KO confirmed by deep sequencing in clone L2-14. IHC detection is completely eliminated in the L2987 L2-14 KO cell line.
由以上质检数据可知，敲除 PD-L1 后细胞样本没有染色，证明抗体的特异性。

特色研究方法

• BM 活检 IHC 新方法

1. 预处理的骨髓样本经福尔马林溶液固定，石蜡包埋，进行 IHC 检测。
2. 用 Immunocal (Stat Laboratory)做脱钙处理，37 °C 90 分钟标准化流程。
3. PD-L1 检测(E.H.代做的)用的是兔单克隆抗体，克隆号为 28-8的abcam 抗体（ab205921），搭配 Envision Flex 兔检测系统和 Envision Flex 兔 linker(DAKO)。
4. 抗原修复用的是抗原修复锅和靶标修复溶液 pH 6.0 (DAKO)。IHC 在自动 IHC/原位杂交平台. Bond-III (Leica Microsystems)上做的。阳性对照为脱钙的扁桃体，经过固定。
5. 为了控制 PD-L1 打分仅针对骨髓瘤细胞，PD-L1 染色的切片还用了小鼠单抗 anti-MUM1 (clone MUM1p) (DAKO; catalog number M7259)进行复染。持续的膜染色被视为阳性。
6. 细胞中 PD-L1 表达量低于 1%，视为阴性；评分在 1%~49% 为弱阳性，大于 50% 为阳性。对于 T 细胞，用 CD3 单抗（DAKO）和 PD-1 单抗（Abcam，克隆号NAT105）。CD3 和 PD-1 IHC 染色被分为阴性 (<5% for CD3, <1% for PD-1)或者阳性 (≥5% for CD3, ≥1% for PD-1)。骨髓淋巴细胞被分为三类: CD-3+/PD-1+ (激活的 T 细胞), CD3+/PD-1− (非活化的 T 细胞)，以及CD-3−/PD-1− (无法检测到的T细胞).

推荐研究工具

1）PD-L1/PD-1 定量检测

靶点	PD-L1	PD-L1	PD1
反应性	Human	Human	Mouse
类型	一步法ELISA	一步法荧光ELISA	一步法ELISA
检测范围(pg/ml)	21.87-1400	2.73-2800	125-8000
货号	ab214565	ab229414	ab210971
备注	*	*

* 使用PD-L1 [28-8]作为捕获抗体

** 一步法ELISA可以90分钟完成ELISA实验

2）IHC 必备试剂
a. 高温/PH 恒定的抗原修复液(ab208572) ，克隆号为 28-8 的 PD-L1 抗体推荐搭配此试剂*
b. Polymer HRP 显色系统 (ab209101)  ，克隆号为 28-8 的 PD-L1 抗体推荐搭配此试剂*
c. 推荐一抗同型对照:  (ab172730)
d. 推荐 Anti-PD1 antibody [NAT105] (ab52587)